Wie funktioniert die HPLC genau?
Hallo!
Konntest du die Blogaufgabe lösen?
Dann bist du sicher bereit für eine detailliertere Erklärung der HPLC.
Die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (oder High Performance Liquid Chromatography: HPLC) ist eine analytische Methode, die auf einem chromatografischen Trennverfahren bei hohem Druck in einer Säule basiert.
Die HPLC ist für die Trennung und Identifizierung von Stoffen geeignet und kann sowohl analytisch (im Labor) als auch präparativ (zur Reinigung von Stoffen in großem Maßstab) verwendet werden.
Wenn du mehr über die Anwendungsgebiete erfahren möchtest, schau in den Exkurs: Anwendungsgebiete der Chromatografie.
Auch in der HPLC wird eine Probe in einem Laufmittel gelöst und über eine stationäre Phase transportiert.
Das Laufmittel ist die sogenannte „mobile Phase“ und fließt ständig durch ein festes, feinporiges Trägermaterial in der Trennsäule.
Nur zu einem Zeitpunkt wird die Probe per Injektor in das Laufmittel gespritzt. Der Trenneffekt in der HPLC beruht auf den unterschiedlichen Polaritäten von stationärer Phase (Säule) und mobiler Phase (Laufmittel). Die verschiedenen Moleküle in der Probe gehen Wechselwirkungen mit dem Trägermaterial der stationären Phase ein, also haften daran und lösen sich wieder ab. Je stärker die Wechselwirkungen, desto mehr werden die Substanzen auf ihrem Weg aufgehalten, wandern also umso langsamer. Die Probe muss im Laufmittel löslich sein, weshalb es unterschiedliche Laufmittel gibt wie z.B. Isopropanol bei Chlorophyll. Für jede Trennaufgabe muss ein geeignetes Laufmittel gefunden werden.
Die flüssige mobile Phase muss für die HPLC frei von Luft sein. Luftblasen stören den gleichmäßigen Fluss des Laufmittels, verstärken Störungen bei der Trennung in der Säule und stören die Signale, die im Detektor ankommen. Deshalb gibt es einen Entgaser, der die Luftblasen aus dem System entfernen kann.
Vor der Säule durchläuft die Probe häufig noch eine Vorsäule, welche die Säule vor Verunreinigungen und Luftbläschen schützt, die nicht vom Entgaser entfernt wurden.
Die Trennsäule besteht aus einem Rohr, das mit feinen Körnern, der sogenannten „stationären Phase“, gefüllt ist. Die Körner in der Säule können je nach Aufgabe aus ganz unterschiedlichen Materialien, wie reinem Sand oder Kunststoffen, bestehen. Sie werden so gewählt, dass die verschiedenen Stoffe aus der Probe unterschiedlich stark an ihnen haften, sich durch das Laufmittel aber auch wieder ablösen. Daher erreichen die verschiedenen Substanzen den Detektor am Ende der Säule zu verschiedenen Zeiten.
Im Bild siehst du, wie sich die verschiedenen Bestandteile der Probe (farbige Punkte) innerhalb der Säule voneinander trennen. (Das sind also nicht die Körner, mit denen die Säule gefüllt ist!) Wenn diese Bestandteile am Detektor ankommen, wird daraus das Diagramm unten erzeugt.
Zur Trennsäule gibt es ein Experiment der KinderForscher an der TUHH zusammen mit dem Knauer Entdecker Klub Berlin, bei dem du deine eigene Trennsäule bauen kannst, um große und kleine Kugeln (“Moleküle”) voneinander zu trennen. Mehr Informationen dazu findest du in diesem Exkurs.
Der Detektor am Ende der Trennsäule macht die Trennung messbar und auf einem Diagramm sichtbar. Der Detektor misst eine Eigenschaft von dem, was gerade an ihm vorbeifließt – das kann je nach Art des Detektors z. B. die Farbe oder die elektrische Leitfähigkeit sein, jedenfalls eine Eigenschaft, in der sich Probe und Laufmittel unterscheiden.
Der Detektor wandelt die Informationen in elektrische Signale um, die in einem Chromatogramm ausgeschrieben werden. Fließt nur das Laufmittel am Detektor vorbei, so wird nichts oder nur ein kleiner Wert gemessen. Je mehr von der Substanz am Detektor ankommt, desto größer ist der Messwert. Die Signale sind auf dem Chromatogramm als Berge, sog. Peaks, erkennbar. Aus der Höhe oder der Fläche des Peaks kann die Konzentration in der Probe berechnet werden. Dazu wird das Chromatogramm mit Diagrammen bekannter Stoffe in bekannter Konzentration verglichen. Außerdem ist die Zeit wichtig, nach der der jeweilige Stoff am Detektor ankommt, die sogenannte Retentionszeit, denn dadurch werden die Stoffe identifiziert.
Auf dem Bild kannst du auf die Hotspots klicken, um noch mehr über die Teile einer HPLC-Anlage zu erfahren.
Viel Spaß!
So, nun kennst du dich schon mit der Funktionsweise einer HPLC-Anlage aus.
Du kannst nun abschließend noch zwei Blogaufgaben zur HPLC und Chromatografie bearbeiten. Viel Spaß!
Abschließend nehmen wir dich gern mit auf eine Tour durch die Labore am ITB (Institut für Technische Biokatalyse) an der Technischen Universität Hamburg, in denen mit der HPLC gearbeitet wird. Zu Beginn des Films wird das ITB vorgestellt, ab Minute 2:50 wird die HPLC im Detail gezeigt und schließlich wird ab Minute 7:30 die Gaschromatografie erläutert. Klicke auf das Bild um das Video zu starten!
Wenn dich interessiert, in welchen Berufen die HPLC angewendet wird und wie in der Industrie mit der HPLC gearbeitet wird, schau gern in unsere Exkurse. Dort erfährst du auch, in welchen Studiengängen du dich tiefergehend mit Chromatografie und HPLC beschäftigen kannst. Außerdem haben wir auf dieser Seite weitere Links zum Thema Chromatografie gesammelt.
Viel Spaß!